一、定义与作用原理
脱氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I，DNase I），是一种能够消化单链或双链DNA的内切核酸酶。这种酶通常来源于牛胰腺，是一种广泛使用的分子生物学工具。其原理是DNase I能够水解DNA的磷酸二酯键，产生含有5'-磷酸基团和3'-OH基团的单脱氧核苷酸和寡脱氧核苷酸。其活性依赖于Ca2+，并可被Mg2+、Mn2+等二价金属离子激活。在Mg2+存在下，DNase I随机剪切双链DNA的任意位点；而在Mn2+存在下，它可以在同一位点剪切DNA双链，形成平末端或1-2个核苷酸突出的粘末端。
图1 DNase I在Mg2+、Mn2+存在下水解双链DNA的原理图
二、RNase-free DNase I的应用
RNase-free DNase I作为一种专为保持RNA完整性而设计的无核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶I，它在分子生物学研究中具有非常广泛的应用。以下是一些主要的应用领域：
1、RNA提取：通过使用DNase I处理RNA样本，可以有效地去除DNA，从而获得高质量的RNA样品用于分子生物学研究。
2、去除RNA样品中的基因组DNA污染：在进行RT-PCR或RNA测序之前，使用RNase-free DNase I处理RNA样品，以去除可能存在的DNA污染，确保RNA数据的准确性。
3、体外转录后去除DNA模板：在体外转录反应后，使用RNase-free DNase I去除剩余的DNA模板，为后续的RNA操作提供纯净的RNA样品。
4、DNase I足迹法：基于DNA和蛋白质结合后，该结合部位在后续的DNase I消化过程中不会被切割，从而在电泳凝胶的放射性自显影图片上留下“足迹”，即显示出未被DNase I切割的DNA片段。这种方法能够精确地定位蛋白质在DNA上的结合位点，是了解转录调控的重要手段。
5、缺口平移法进行DNA标记：利用DNA酶在DNA双链上制造缺口，并通过大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的多种酶促活性将标记的三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）掺入新合成的DNA链中，从而合成高比活性的均匀标记的DNA探针，用于多种分子生物学研究。
6、细胞培养过程中的应用：在细胞培养过程中，RNase-free DNase I可以作为添加物，帮助消化细胞间的粘连，促进细胞分散。
7、TUNEL检测中的阳性对照：在细胞凋亡的TUNEL检测中，RNase-free DNase I可用于部分剪切基因组DNA，作为阳性对照。
8、生产高质量RNA：RNase-free DNase I在生产过程中的应用，可以确保从RNA合成起始阶段就维持高质量标准，提高最终产品的质量和一致性。
三、RNase-free DNase I的选择标准
1、RNase残留少：
研究者需确保所选的DNase I产品是低RNase残留的，这对于保持RNA样品的完整性至关重要，这是因为在生物实验中，RNase的存在可能会对实验结果造成负面影响。
DNase I主要用于降解RNA样品中的DNA，但在处理过程中，如果DNase I本身含有RNase活性，那么在去除DNA的同时，也可能会降解样品中的RNA，从而导致实验结果不准确，尤其是对于一些RNA丰度较低的样本检测，往往会导致相反的实验结果。因此，选择RNase残留少的Dnase I是确保实验准确性的关键。目前，像国际知名品牌Thermo Fisher、Takara，国内的Starvio等都具备充分纯化的DNase I产品。
2、DNase I活性高
选择高活性的DNase I在提高酶切效率方面起着非常重要的作用。高活性的DNase I能够在较短时间内高效地切割DNA，有效减少了实验所需的时间和成本，这对于需要快速处理大量RNA样本的实验尤为重要。那么，如何高效选择高活性的DNase I呢？我们实验室经验，不要看厂家标称的活性单位，要进行实验筛选，实验方法最好选用qPCR。以此方法，我们筛选了国内4家公司的DNase I。其中，Starvio RNase-free DNase I活性表现最为出色，只需0.5uL即可充分消化1ug细胞RNA中伴存的DNA，不经RT直接qPCR检测出的GAPDH的CT值大于40，完全符合诊断试剂的研制要求。
图A为未使用Starvio RNase-free Dnase I处理的1ug细胞RNA样本中GAPDH的扩增曲线。图B为0.5uL Starvio RNase-free Dnase I处理后的1ug细胞RNA样本中GAPDH的扩增曲线。
